Центр "Биоинженерия" Российская Академия Наук

Лаборатория систем молекулярного клонирования

Области интересов
Состав Лаборатории
Основные достижения
Избранные публикации и Патенты

Заведующий Лабораторией:
РАВИН НИКОЛАЙ ВИКТОРОВИЧ
Доктор биологических наук
Заместитель директора Центра «Биоинженерия»РАН
тел.: 8 (499)-7833264
факс: 8 (499)-135-0571
e-mail: nravin@biengi.ac.ru

О лаборатории

Лаборатория проводит фундаментальные и прикладные исследования в области вирусологии, молекулярной генетики и генетической инженерии микроорганизмов и растений. Основными направлениями исследования является расшифровка геномов микроорганизмов и органелл растений, исследование механизмов репликации ДНК и экспрессии генов микроорганизмов, исследование механизмов вирусной инфекции растений и разработка новых методов продукции в растениях рекомбинантных белков медицинского назначения, основанных на использовании вирусных векторов.

Сотрудники лаборатории:

		ФИО, должность, ученая степень		ФИО, должность, ученая степень
		Равин Николай Викторович зам. директора, заведующий лабораторией, д.б.н.		Замчук Людмила Андреевна ведущий научный сотрудник, д.б.н.
		Куприянов Виктор Васильевич старший научный сотрудник, к.б.н.		Ракитин Андрей Львович старший научный сотрудник, к.б.н.
		Дорохов Борис Дмитриевич научный сотрудник, к.б.н.		Марданов Андрей Владимирович научный сотрудник, к.б.н.
		Смагин Владимир Анатольевич аспирант		Марданова Евгения Сергеевна аспирант
		Котляров Роман Юрьевич аспирант		Гумеров Вадим Мирбаевич аспирант

Основные направления исследований и наиболее важные достижения лаборатории

1) Молекулярная биология растения и биотехнология

1.1) Растения – «биофабрики»: новые системы продукции в растениях рекомбинантных белков медицинского назначения, основанные на использовании фитовирусных векторов.
Создан набор высокоэффективных самореплицирующихся вирусных векторов на основе геномов Х-вируса картофеля и вируса табачной мозаики, разработаны технологии подавления защитных реакций растений, основанные на использовании новых ингибиторов пост-транскрипционного ген-сайленсинга. Создана фитовирусная система экспрессии в растениях Б-субъединицы термолабильного энтеротоксина E. coli, обеспечивающего формирование протективного иммунитета от колидиарреи. Выход продукта достигает 2% общего растворимого белка, синтезированный в растениях LTB способен образовывать пентамеры, являющиеся иммуногенной формой белка. Созданы высокоэффективные системы получения в бактериальных и растительных клетках рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе ядерного антигена вируса гепатита Б, которые могут быть использованы для создания противогриппозных вакцин.

Рисунок 1. Растительные вирусы – векторы для продукции белков в растениях

1.2) Структура и эволюция хлоропластных геномов растений
Определена полная нуклеотидная последовательность хлоропластного генома ряски (Lemna minor), первый геном клеточных органелл, просеквенированный в России. Установлено, что хлоропластная ДНК Lemna minor представляет собой кольцевую молекулу длиной 165995 нуклеотидов, идентифицировано 114 уникальных генов, из которых 80 могут кодировать белки, 30 – транспортные РНК и 4 – рибосомные РНК. По функциональным характеристикам большая часть генов может быть отнесена к двум категориям – гена аппарата транскрипции и трансляции и гены фотосинтетического аппарата. Предложена модель эволюции хлоропластных геномов цветковых растений.

Рисунок 2. Структура хлоропластного генома ряски, Lemna minor

2) Молекулярная генетика и геномика микроорганизмов
2.1) Расшифровка геномов термофильных микроорганизмов.
Расшифровка полных структур геномов микроорганизмов является одной из фундаментальных основ для проведения исследований в области микробиологии, молекулярной биологии и эволюции микроорганизмов, а также имеет практическое значение для медицины и биотехнологии. Гипертермофильные микроорганизмв, - бактерии и археи, являются представителями древнейших форм жизни, сохранившихся в экстремальных местообитаниях и, как правило, представляет новые таксоны, в ряде случаев – глубокие филогенетические ветви, т.е. не имеет близкородственных организмов среди известных в настоящее время. При этом широкий спектр используемых субстратов и образуемых продуктов предполагает существование у этой группы микроорганизмов разнообразных полноценных систем метаболизма.
В 2007г. нами расшифрована полная структура генома гипертермофильной археи Desulfurococcus kamchatskensis (оптимальная температура роста 85С), выделенной из гейзера в Камчатской области. Установлено, что размер генома составляет 1,36 млн. нуклеотидов, идентифицировано 1489 белок-кодирующих генов, из которых около четверти являются уникальными для этого микроорганизма, а также набор генов транспортных и рибосомных РНК. Идентифицированы и клонированы гены, кодирующие новые термостабильные ферменты, которые могут быть использованы в промышленности, медицине и сельском хозяйстве.
В 2008г. планируется определить полные нуклеотидные последовательности геномов не менее 5 термофильных микроорганизмов из уникальной коллекции лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии РАН.

Рисунок 3. Расшифровка геномов термофильных микроорганизмов.

2.2) Особенности молекулярной генетики и механизма репликации ДНК прокариотичеких организмов с линейными хромосомами.
Определена структура генома уникального объекта - бактериофага N15 (46433 нт), который в лизогенном состоянии не интегрируется в хромосому E. coli, а представляет собой линейную плазмиду c ковалентно замкнутыми концами (теломерами). Стабильное наследование плазмидного профага N15 обеспечивается за счет правильного распределения реплицированных молекул между дочерними клетками при делении. Показано, что функционирование механизма стабильного наследования линейных репликонов требует, в отличие от кольцевых плазмид, наличия множественных центромерных сайтов, расположенных в различных районах генома. Созданы линейные векторы на основе N15 и показаны их преимущества по сравнению с кольцевыми при клонировании ДНК с потенциальными особенностями вторичной структуры. Предложена и впервые в мире экспериментально доказана модель репликации линейной ДНК с ковалентно замкнутыми теломерами для прокариот.

Рисунок 4. Модель репликации ДНК плазмиды N15.

Репликация инициируется с внутреннего ori сайта, расположенного несимметрично относительно центра молекулы и является двунаправленной. После дупликации левой теломеры, протеломераза разрезает эту последовательность, образуя Y- образную молекулу. Репликация и последующий процессинг правой теломеры приводит к образованию двух дочерних линейных молекул. Репликация других прокариотических линейных ДНК с ковалентно замкнутыми теломерами следует той же модели. В то же время репликация ДНК эукариотических организмов с аналогичной структурой хромосом протекает иначе, что свидетельствует в пользу эволюционно независимого появления про- и эукариотических организмов с ковалентно замкнутыми теломерами.

Избранные публикации:

1) Ravin, N.V., Rech, J., & Lane, D. (2003). Mapping of functional domains in F plasmid partition proteins reveals a bipartite SopB-recognition domain in SopA. J. Mol. Biol., 329, 875-889.
2) Ravin, N.V., Kuprianov, V.V., Gilcrease, E.B., & Casjens, S.R. (2003) Bidirectional replication from an internal ori site of the linear N15 plasmid prophage. Nucleic Acids Res. 31, 6552-6560.
3) Ravin, N.V. (2006). N15: the linear plasmid prophage, in «The Bacteriophages» (Calendar, R., ed.), Oxford University Press, UK.
4) Mardanov A.V., Strakhova T.S., Smagin V.A., Ravin N.V. (2007) Tightly regulated, high-level expression from controlled copy number vectors based on the replicon of temperate phage N15. Gene, 395: 15–21.
5) Ravin N.V., Mardanova E.S., Kotlyarov R.Yu., Novikov V.K., Atabekov J.G., Skryabin K.G. (2008) Complete sequencing of potato virus X new strain genome and construction of viral vector for production of target proteins in plants. Biochemistry (Moscow), 73(1), 44-49.
6) Mardanov A.V., Ravin N.V., Kuznetsov B.B., Samigullin T., Antonov A.S., Kolganova T.V., Skryabin K.G. (2008) Complete sequence of the duckweed (Lemna minor) chloroplast genome: structural organisation and phylogenetic relationships to other angiosperms. J. Mol. Evol. (in press).

Патенты:

1) Эльконин Л.А., Лешко Е.В., Чумаков М.И., Волохина И.В., Равин Н.В., Скрябин К.Г. (2004) Способ получения трансгенных растений сорго. Патент РФ № 2229793.
2) Марданов А.В., Равин Н.В. (2007) Вектор на основе репликона бактериофага N15 и рекомбинантный вектор для регулируемой экспрессии целевого гена в клетках Escherichia coli, штамм Escherichia coli, обеспечивающий возможность регуляции числа копий вектора, и система экспрессии. Патент РФ №2312146