Журнал "Биотехнология", 2007, №6, с.27-33.

Нескородов Я.Б., Мишуткина Я.В., Гапоненко А.К., Скрябин К.Г.

Разработан эффективный способ стерилизации семян подсолнечника, позволяющий получить 100%-ный выход асептического материала для культивирования in vitro. Оптимизирован независимый от генотипа способ регенерации побегов из семян подсолнечника in vitro. Частота регенерации побегов составила от 83,5 до 90,3%. Разработанная методика получения in vitro побегов из асептических семян может быть использована для проведения работ по генетической трансформации подсолнечника.

Neskorodov Ya.B., Mishutkina Ya.V., Gaponenko A.K., and Skryabin K.G.

An efficient method for sunflower seed sterilization that allows to obtain to a 100% yield of aseptic seeds for in vitro culturing has been worked out. A genotype-independent protocol for the in vitro shoot regeneration from sunflower seeds was optimized. Frequency of shoot regeneration was from 83,5% to 90,3%. The developed protocol can be used to the of sunflower genetic transformation.

Список сокращений: БАП - 6-бензиламинопурин; ДИ - доверительный интервал; среда MS - питательная среда Мурасиге-Скуга.

Подсолнечник (Helianthus annuus L.), наряду с соей (Glycine max L.) и рапсом (Brassica napus L.), является одной из трёх важнейших масличных культур мира. Поданным Федеральной антимонопольной службы РФ, в России предпочтительно потребляют подсолнечное масло, которое используется в повседневном рационе населения и является важнейшим сырьём для кондитерской и пищевой промышленности[1].

Повышение устойчивости высокопродуктивных сортов подсолнечника как важнейшей масличной культуры к биотическим и абиотическим стрессам, а также получение технических сортов для биоремидиации почв методами генетической инженерии несомненно, представляет большой интерес. Однако, подсолнечник относится к видам с низкой компетентностью к генетической трансформации, что, в первую очередь, обусловлено отсутствием эффективной воспроизводимой системы регенерации побегов in vitro. Показано, что частота регенерации подсолнечника in vitro варьирует в зависимости от типа используемого экспланта, генотипа и состава питательных сред. Большинство исследований проведены на сортах, инбредных линиях и гибридах иностранной селекции [2, 3, 4, 5, 6, 7]. Разработка отечественной методики эффективной регенерации побегов подсолнечника in vitro позволит оптимизировать процесс получения растений с новыми хозяйственно-ценными признаками.

Целью нашего исследования было оптимизировать процесс регенерации побегов in vitro для хозяйственно-ценных сортов подсолнечника (Helianthus annuus L.) российской селекции, предназначенных для основных районов возделывания данной культуры в РФ.

УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Растительный материал. В работе использовали семена следующих сортов подсолнечника, районированный в Волго-Вятской, Центрально-Черноземной, Северо-Кавказской, Средневолжской, Нижневолжской, Уральской, Западно-Сибирской зонах: Азовский, Донской крупноплодный, Казачий, Мастер, Саратовский 85, Скороспелый 87, Юбилейный 60.

Состав сред и условия культивирования.Растительный материал культивировали при 27°С (±2°С), в темноте (проращивание), далее на свету с 16-часовым фотопериодом (16/8 – день/ночь). Для освещения использовали лампы Osram L36/77 FLUORA и F36W/33 Cool White. В состав всех питательных сред входили макро и микросоли MS [8], витамины "В5" [9], фитогормоны и углеводы. рН среды доводили до 5.8 перед автоклавированием. Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве при давлении 1.2 атмосферы в течение 15 мин.

Стерилизация растительного материала.В качестве стерилизующего агента использовался 30% раствор коммерческого отбеливателя «Белизна» (ТУ-2382-255-00209645-2002), содержащий в качестве активного вещества гипохлорит натрия. Стерилизация проводилась двумя способами.

Способ стерилизации №1. Семена очищали от наружной твердой оболочки и помещали в 30%-ный раствор коммерческого отбеливателя «Белизна». Время экспозиции - 10, 15, 20 или 40 мин при постоянном перемешивании. После обработки раствором гипохлорита натрия семена промывали стерильной водой в течение 30 мин. Каждые 10 мин воду меняли.

Способ стерилизации №2. Семена подсолнечника (1000 шт.) замачивали в 1 л воды, с использованием в качестве детергента 2-3 капли твин-20, в течение 2-3 ч с постоянным помешиванием. Воду меняли каждый час. При смене воды отбирали семена, концентрирующиеся в верхнем слое воды - нижнюю фракцию удаляли. Затем отобранные семена очищали от наружной твердой оболочки и помещали в дистиллированную воду с 2-3 каплями твин-20. В данном растворе семена выдерживали один час при постоянном перемешивании. Раствор обновлялся через 30 мин инкубации. Далее стерилизацию семян проводили в условиях ламинарного бокса. Подготовленные семена помещали в 30%-ный раствор «Белизны» на 15 мин, при постоянном перемешивании, затем промывали в течение 30 мин в стерильной воде. Каждые 10 мин воду меняли. Все семена, изменившие цвет, удаляли, даже если это изменение затрагивало меньшую часть семени (рис.1, B, C, D, E). Отобранные семена, не изменившие цвет, подвергали повторной стерилизации – 5 мин в 30%-ном растворе «Белизны» (см.рис.1, А). Затем семена промывали в течение 30 мин в стерильной воде при комнатной температуре. Каждые 10 мин воду меняли.

Культивирование растительного материала

Метод получения эксплантов для регенерации №1[10]. 1. Стерилизованные семена высаживали в пробирки, содержащие 10 мл 50%-ной по концентрации солей среды MS, 10% сахарозы и 0,8 % агар-агара и проращивали в течение 6 суток. Достигшие 4-6 сантиметров в высоту растения (на стадии «первых» листьев) извлекали из пробирок в асептических условиях и рассекали скальпелем на три диска толщиной 2-3 мм. Экспланты, полученные ниже высечки «С», были не компетентны к регенерации (рис.2). Полученные экспланты переносили на MS среду, содержащую витамины комплекса B-5, 30г/л сахарозы , 1мг/л фитогормона БАП. Экспланты располагали на среде в соответствии с их первоначальной локализацией в гипокотиле (см. рис.2) и культивировали в течение 6 сут до появления побегов.

Метод получения эксплантов для регенерации №2. Стерильные семена помещали в круглодонные колбы (рис.3.), содержащие 80 мл жидкой 10%-ной среды MS, без витаминов, фитогормонов и сахарозы. Затем их проращивали в течение 48 часов при постоянном помешивании 100 об/мин. У проростков отсекали корни и удаляли верхние 2/3 части семядолей. Полученные фрагменты гипокотиля рассекали вдоль, разделяя апикальную почку на две равные части. Полученные половинки гипокотиля располагали внутренней частью вверх и рассекали вдоль через апикальную почку, разделяя её на две равные части. В результате этих процедур из одного проростка получали четыре экспланта, которые для регенерации побегов помещали срезом вверх на среду MS, содержащую витамины B-5 , 30 г/л сахарозы , 1мг/л БАП. Культиввирование полученных эксплантатов проводили в течение двух суток до появления побегов; регенерация во всех случаях проходила в области рассечённой апикальной почки. На одном экспланте могло регенерировать от одного до четырех побегов (рис.4).

Статистическая обработка данных.Статистическую обработку данных проводили с использованием стандартных методик подсчета стандартного отклонения и доверительного интервала с заданным значением достоверности 95%.

ДИ рассчитывали по формуле:

где χ - среднее значение оцениваемой величины, полученное экспериментально для каждого генотипа (%), σ - стандартное отклонение, n - генеральная совокупность, которую расчитывали по формуле:

σ =

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Стерилизация семян и проращивание

Получение асептических проростков подсолнечника для проведения экспериментов in vitro является достаточно сложной задачей в связис их высокой бактериальной и грибной зараженностью. В большинстве случаев в качестве стерилизующего агента используются растворы коммерческих отбеливателей («Chlorex», «Domestos», «Белизна»), содержащих гипохлорит натрия, при времени стерилизации от 10 до 30 минут [5, 6, 7]. Для стерилизации семян по методу №1 использовали 30%-ный раствор коммерческого отбеливателя «Белизна». Время экспозиции составляло 10 мин, 15, 20 и 40 мин. Полученные данные приведены в табл. 1. Как видно из представленных данных удалось получить высокий выход стерильных семян. Однако, если стерильность семян составляет менее 100%, в дальнейшем можно использовать только культивирование каждого семени, так как в противном случае может произойти массовое заражение других семян. Увеличение времени экспозиции с 20 до 40 мин, использованное для сорта Мастер, не привело к повышению доли стерильных семян (см. табл. 1).У большинства семян после 40-минутной стерилизации наблюдались многочисленные нарушения в развитии: 18% составляли «карлики», которые к концу 7-го дня культивирования не превышали 2 см в высоту, 19% растений росли корнями вверх, у 10% семян был поврежден корневой конус нарастания, а 3% растений были представлены альбиносами. Из 365 использованных семян сорта Мастер после 40 мин стерилизации 30%-ным раствором «Белизны» 11% остались зараженными, а 50% имели явные нарушения в развитии, т.е.потери растений в процессе стерилизации составили 61%. Для получения 100%-ной стерильности семян, нами была разработана методика, которая позволила уменьшить время стерилизации до 15 мин при той же концентрации активного агента (см. "Условия эксперимента", Способ стерилизации №2).

В процессе работы нами было отмечено, что после обработки семян 30%-ным раствором «Белизны» часть семян меняла цвет полностью или отдельными участками: от темно-зеленого до бледно-серого (см.рис.1). При проращивании на питательной среде у этих семена проявлялось бактериальное или грибное заражение, либо они были не жизнеспособными.

Основываясь на данном наблюдении, после обработки семян 30%-ным раствором «Белизны» мы удаляли все семена, изменившие цвет, даже если это изменение было очаговым. Сорта подсолнечника различались по количеству семян, изменивших цвет после воздействия «Белизны», что позволило определить уровень зараженности для данной партии в целом. Например, партия семян сорта Мастер была поражена на 90%, а сорта Азовский - только на 15%. Данный результат позволил нам в дальнейшем рассчитывать количество семян для использования в экспериментах.

Применив методику сортировки семян по признаку изменения цвета в процессе стерилизации ко всем используемым в работе сортам подсолнечника, мы получили 100%-ный выход асептических семян в группе с неизменённым цветом. Это позволило применить данный способ для массового проращивания семян в колбах, не опасаясь заражения всей партии от одного семени.

Регенерация побегов

Так как целью исследования была оптимизация процесса регенерации побегов in vitro для различных сортов подсолнечника (Helianthus annuus L.) российской селекции, мы исследовали влияние типа экспланта на частоту образования побегов in vitro для 6 сортов подсолнечника.

Наиболее часто используемыми типами эксплантов подсолнечника для трансформации и регенерации побегов в культуре in vitro являются незрелые и зрелые зародыши. По литературным данным, в работах со зрелыми зародышами в качестве эксплантов использовали область апекса побега. Экспланты получали из проростков на стадии «первых» листьев [10] либо непосредственно из стерилизованных семян [7]. В данной работе мы применяли оба способа получения эксплантов. В первом варианте экспериментов в качестве источников эксплантов использовали проростки на стадии первых листьев. Экспланты представляли собой высечки гипокотиля (см. рис.2). Данные по частоте регенерации представлены в табл.2.

Частота регенерации побегов из эксплантов, полученных по методу №1, варьировала в среднем от 15,2% до 25% и показала некоторую зависимость от генотипа. Так, для сорта Донской крупноплодный частота регенерации составила в среднем 16,1%, а для сорта Скороспелый 87 – 25% (см. табл. 2).

Экспланты, получаемые по данному методу, были формально разделены на три группы (А, В, С) по признаку своей первоначальной локализации в гипокотиле (см. рис.2). Нами была замечена зависимость частоты регенерации побегов от первоначального расположения диска экспланта в гипокотиле растения (см. далее). Например, для сорта Азовский группы эксплантов имели следующую частоту регенерации почек: группа А – 8,34%, группа В – 54,81%, группа С – 36,84% (рис.5). Подобное распределение эффективности регенерации между группами эксплантов отмечали с небольшими вариациями и для других сортов.

Во втором варианте экспериментов в качестве источника эксплантов использовали зрелые зародыши (семена) (см. рис.3). Однако вычленение апекса у зрелых зародышей непосредственно после стерилизации является сложной задачей, так как семена подсолнечника твёрдые и хрупкие, это затрудняет изоляцию нужной области в неповреждённом состоянии. Для решения этой проблемы семена подсолнечника помещали в колбы с обеднённой средой на 40-48 ч (см. “Условия эксперимента”, метод №2 получения эксплантов для регенерации). Полученные из семян экспланты культивировали на той же среде, что и экспланты в первом варианте. Данные по частоте регенерации проростков представлены в табл.3.

Частота регенерации побегов из эксплантов, полученных по методу №2, варьировала от 83,5 до 90,3% и полученные данные не указывали на достоверную зависимость от генотипа подсолнечника.

Сравнение эффективности двух методик регенерации побегов из эксплантов

Разработанный нами метод регенерации №2 показал ряд преимуществ в сравнении с методом регенерации №1:

1. время культивирования растений до момента получения эксплантов существенно сокращается. Если при использовании метода №1 требовалось выращивать растения в течение 6 дней, то по методу №2 время эксперимента сократилось в 3 раза и необходимые экспланты получали уже на вторые сутки культивирования;
2. cуммарный выход эксплантов при использовании метода №1 из одного проростка составляет 3, а по методу № 2-4;
3. эффективность регенерации побегов из эксплантов в несколько раз выше при использовании метода №2 по сравнению с таковой при использовании метода №1. Например, для сорта Азовский частота регенерации увеличилась почти в 5 раз с 18,3 до 89,8%, а для сорта Донской крупноплодный в 5,5 раз –с 16,1 до 89,9%. Результаты сравнения эффективности регенерации из эксплантов, получаемых методами изоляции сегментов гипокотиля (№1) и методом рассечения семян (№2), представлены также на рис.6;
4. помимо перечисленных преимуществ метода №2 немаловажным является отсутствие необходимости индивидуального проращивания каждого семени на агаризованной среде. Было отмечено, что при массовом культивировании семян уменьшение концентрации питательной среды MS в 10 раз и удаление из неё сахарозы не сказывается на их всхожести. Все используемые в работе сорта показали 100%-ную всхожесть. Это наблюдение позволило в последующих опытах использовать минимизированную (концентрация была снижена в 10 раз от первоначальной) среду MS, не содержащую сахарозу, фитогормоны и агар-агар, для проращивания семян подсолнечника. Основным преимуществом подобной процедуры массового проращивания является сравнительная дешевизна и простота процесса, что не может быть достигнуто при индивидуальном культивировании из расчёта одно семя на одну пробирку.

Таким образом, разработана эффективная система стерилизации семян подсолнечника, позволяющая получать 100% стерильных семян, которые в результате отбора неповреждённых вариантов сохраняют 100%-ную всхожесть, что дало возможность массового проращивания семян для дальнейшей работы в культуре in vitro. Разработан высокоэффективный метод регенерации подсолнечника in vitro, использующий в качестве источника эксплантов зрелые зародыши (семена). Метод позволяет получать из одного семени подсолнечника 4 экспланта с высоким регенерационным потенциалом. Частота регенерации побегов на полученных эксплантах составила 83,5% до 90,3 % в зависимости от генотипа. Произведено сравнение разработанного нами метода с методом, в котором источником эксплантов служили проростки на стадии первых листьев. Частота регенерации побегов по разработанной нами методике была выше в 5-6 раз в зависимости от используемого генотипа. Проведена оценка влияния генотипа растения на регенерацию побегов. Достоверное влияние генотипа на частоту регенерации побегов in vitro не было выявлено, т.е. определяющим фактором регенерации является тип экспланта, а не генотип.

Рис.1. Семена подсолнечника после обработки 30%-ным раствором коммерческого отбеливателя «Белизна».

A - нормальное семя; B, C, D, E - семена, изменившие цвет.

Рис.2. Получение эксплантов для регенерации побегов методом №1

A, B, C - диски высечек.

Рис.3. Получение эксплантов для регенерации побегов по методу №2

Рис.4. Эксплант подсолнечника, полученный при регенерации по методу №2 (третий день культивирования)

A - область регенерации побега (рассеченная апикальная почка); B - семядоля; C - срез отсеченного корня

Рис.5. Частота регенерации побегов в зависимости от первоначального расположения диска экспланта в гипокотиле растения (сорт Азовский)

Рис.6. Сравнение частоты регенерации побегов из эксплантов, полученных методом №1 и №2

ЛИТЕРАТУРА

• [1] Федеральная антимонопольная служба РФ. 2006. Обзор рынка подсолнечного масла. http://www.fas.gov.ru
• [2] Knittel N., Escandon A. S., Hahne, G. Plant regeneration at high frequency from mature sunflower cotyledons. Plant Sci., 1991. 73: 219-226.
• [3] Power C. J. Organogenesis from Helianthus annuus inbreds and hybrids from the cotyledons of zygotic embryos. Amer. J. Bot., 1987. 74: 497-503.
• [4] Lupi M.C., Bennici A., Locci F., Gennai D. Plantlet formation from callus and shoot-tip culture of Helianthus annuus L. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 1987. 11: 47-55.
• [5] GUrel Е., Kazan К. Development of an Efficient Plant Regeneration System in Sunflower( Helianthus annuus L.). Tr. J. of Botany., 1998. 22. 381-387
• [6] Hewezi T., Perrault A., Alibert G., Kallerhoff J. Dehydrating Immature Embryo Split Apices and Rehydrating With Agrobacterium tumefaciens: A New Method for Genetically Transforming Recalcitrant Sunflower. Plant Molecular Biology Reporter., 2002. 20: 335–345.
• [7] Malone-Schoneberg J., Scelonge C., Burrus M., Bidney D. Stable transformation of sunflower using Agrobacterium and split embryonic axis explants, Plant Science, 1994. 199-207.
• [8] Murashige T., Skoog F. A. Revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant Physiol., 1962. V. 15. P. 473–476
• [9] Gamborg O. The effects of amino acid and ammonium on the growth of plant cells in suspension cultures. Plant Physiol., 1970. V. 45. P. 372–375
• [10] Гапоненко А.К. Патент РФ на изобретение: «Способ получения трансгенных растений подсолнечника» №2179187, C1(51) c12N15/82,5/10A01н1/04,4/06,2002.